高效液相色譜儀在進行多成分的復雜樣品分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不*，后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰形較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并相互分離，往往要用到梯度洗脫技術。

　　在高效液相色譜儀中流速（壓力）梯度洗脫和溫度梯度洗脫效果不大，而且會帶來一些不利影響，因此，高效液相色譜儀中的梯度洗脫通常指流動相梯度洗脫，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。

　　高效液相色譜儀梯度洗脫系統(tǒng)也稱為梯度洗脫或程序洗脫。在相同的分析周期中，流動相的濃度比按一定的步驟不斷變化，稱為梯度洗脫。原理：流動相由幾種不同極性的溶劑組成。通過改變流動相中溶劑的比例和改變流動相的極性，每個組分都有一個合適的容量系數(shù)k，樣品中的所有組分都能在最短的時間內(nèi)達到最佳的分離特性：提高柱效率和提高分離效率。檢測靈敏度。敏感。當樣品中某一峰的k‘值比上一峰高出幾十至數(shù)百倍時，梯度洗脫效果特別好。在梯度洗脫過程中，必須采用恒流泵來保證流速的穩(wěn)定性，否則很難得到重復的結果。

　　高效梯度液相色譜儀進行梯度洗脫時，選定溶劑A、B之后，設定梯度速度和梯度時間，確定梯度曲線形狀，要以經(jīng)濟的梯度洗脫程序，實現(xiàn)樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：

　　1、溶劑的純度要高，否則會使梯度洗脫的重現(xiàn)性變壞。

　　2、梯度混合的溶劑互溶性要好，應防止不互溶的溶劑進入色譜柱。

　　3、注意溶劑的粘度和密度對混合流動相組成的影響。

　　4、梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇型檢測器，而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器。